Comparación de tres técnicas para subtipificación molecular de Listeria monocytogenes / Comparison of three molecular subtyping techniques for Listeria monocytogenes

Abstract Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen. The recent alert for L. monocytogenes in vegetables from Argentina warns about the importance of reinforcing its isolation, characterization and subtyping in food, clinical and environmental samples. The aim of the present study was to compare the discriminatory power of enterobacterial repetitive interpower; genic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR), automated ribotyping and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) to subtype strains of L. monocytogenes isolated from Argentine meat and environmental samples. Simpson's Diversity Index (DI) was calculated on the basis of based on the dendrograms obtained in the by cluster analysis, showing the following discriminatory power: ApaI-PFGE (0.980), AscI-PFGE (0.966), ribotyping (0.912), ERIC-PCR (0.886). The ID values between ApaI- and AscI-PFGE and between ribotyping and ERIC-PCR were not significantly different. Of the three techniques evaluated, PFGE showed the highest discriminatory power. However, the subtyping techniques should be accompanied by effective food monitoring strategies and reliable clinical and epidemiological studies.

Resumen Listeria monocytogenes es un patógeno alimentario. La reciente alerta por la presencia de L. monocytogenes en vegetales en Argentina advierte sobre la importancia de reforzar el aislamiento, la caracterización y la subtipificación de esta bacteria en muestras clínicas de alimentos y ambientales. El objetivo del presente estudio fue comparar el poder discriminatorio de enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR), la ribotipificación automatizada y la pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) para subtipificar cepas de L. monocytogenes aisladas de carne y de muestras ambientales en Argentina. El índice de diversidad (ID) de Simpson, calculado a partir de los dendrogramas obtenidos en el análisis de agrupamiento, mostró los siguientes resultados: Apal-PFGE (0,980), AscI-PFGE (0,966), riboti-pado (0,912), ERIC-PCR (0,886). Los valores obtenidos no fueron significativamente diferentes al comparar entre Apal- y AscI-PFGE, ni entre ribotipadoy ERIC-PCR. De las técnicas evaluadas, la PFGE presentó el mayor poder discriminatorio. Sin embargo, las técnicas de subtipificación deberían acompañarse de estrategias de control de los alimentos efectivas y de estudios clínicos y epidemiológicos confiables.

Prevalence and serotype distribution of Listeria monocytogenes isolated from foods in Montevideo-Uruguay

ABSTRACT The aim of this work was to study the prevalence of Listeria monocytogenes in foods obtained in retail shops and food industries located in Montevideo-Uruguay, and to identify the serogroups of the obtained isolates. Three-thousand one-hundred and seventy-five food samples (frozen, deli meats, ready-to-eat and cheese) were analyzed. The obtained isolates were serogrouped by multiplex PCR and serotyped by conventional procedure. Genetic comparisons were performed using pulsed-field gel electrophoresis on a sub-set of isolates belonging to the same serotype successively recovered from the same establishment. L. monocytogenes was isolated from 11.2% of samples. The highest prevalence was observed in frozen foods (38%), followed by cheese (10%). 1/2b and 4b were the most frequently identified serotypes. In six of 236 analyzed establishments we successively recovered L. monocytogenes isolates belonging to the same serotype. Most of them corresponded to serotype 1/2b. Pulsed-field gel electrophoresis profiles suggest that at least 33% of L. monocytogenes 1/2b isolates are genetically related and that may remain viable for prolonged periods. The observed prevalence of L. monocytogenes was lower than reported in neighboring countries. Our findings highlight the role that frozen foods may play in the spread of this pathogen, and the relevance of serotypes 1/2b and 4b.

Avaliação da atividade antimicrobiana de extratos de Eugenia anomala e Psidium salutare (Myrtaceae) frente à Escherichia coli e Listeria monocytogenes / Evaluation of the antimicrobial activity of extracts of Eugenia anomala and Psidium salutare (Myrtaceae) against the Escherichia coli and Listeria monocytogenes

RESUMO As doenças transmitidas por alimentos ocorrem principalmente devido à ingestão de alimentos contaminados por microrganismos patogênicos, dentre eles a Escherichia coli e Listeria monocytogenes. Uma das alternativas estudadas para minimizar a contaminação de alimentos é o emprego de plantas, ou seus extratos, como agentes antimicrobianos de origem natural em produtos alimentícios. Desta forma o objetivo do presente estudo é fornecer dados científicos a respeito de duas plantas nativas do RS ainda não estudadas, Eugenia anomala e Psidium salutare, visando potencial emprego como agente antimicrobiano natural em alimentos. Para tanto, avaliou-se a atividade antimicrobiana de extratos de E. anomala e P. salutare contra E. coli e L. monocytogenes através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pelo método de microdiluição em caldo, a capacidade antioxidante dos extratos por meio do método de redução do radical DPPH e a citotoxicidade in vitro empregando células CHO-K1. Os resultados obtidos mostraram que os extratos de acetato de etila e etanólico de ambas as espécies possuem ação antioxidante muito alta, de 94,08% e 93,86%, respectivamente. Apenas o extrato hexânico de P. salutare apresentou ação antimicrobiana moderada (CIM = 312,5 µg/mL). Todos os extratos apresentaram ação citotóxica sendo que os maiores percentuais foram do extrato clorofórmico de E. anomala (77,05%) e hexânico de P. salutare (76,79%), na concentração de 100 µg/mL. Assim, o presente estudo demonstrou que as espécies vegetais estudadas apresentam potencial para emprego como agente antimicrobiano destes microrganismos.

ABSTRACT The foodborne diseases occur mainly due to the ingestion of food contaminated by pathogenic microorganisms, including Escherichia coli and Listeria monocytogenes. One of the alternatives studied to minimize contamination of food is the use of plants or their extracts as antimicrobial agents naturally occurring in food products. The objective of this study is to provide scientific data on two native plants of RS have not studied Eugenia anomala and Psidium salutare for a potential use as a natural antimicrobial agent in food. To this end, we evaluated the antimicrobial activity of extracts of E. anomala and P. salutare against E. coli and L. monocytogenes by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) by the broth microdilution method, the antioxidant capacity of the extract for means DPPH radical reduction method and in vitro cytotoxicity using CHO-K1 cells. The results showed that the ethyl acetate and ethanolic extracts of both species have very high antioxidant activity, of 94.08% and 93.86%, respectively. Only the hexane extract of P. salutare showed a moderate antimicrobial activity (MIC = 312.5 mg/mL). Moreover, all extracts showed cytotoxic action of which the highest percentages were the chloroform extract of E. anomala (77.05%) and hexane P. salutare (76.79%) at a concentration of 100 mg/mL. Thus, the present study showed that plant species have potential for use as an antimicrobial agent against these microorganisms.

Incorporação de antimicrobianos naturais em filme biodegradável à base de alginato para o controle de Listeria monocytogenes em embutido cárneo fatiado / Incorporation of natural antimicrobials into alginate based film for the control of Listeria monocytogenes in sliced meat product

A incorporação de substâncias antimicrobianas, entre elas os óleos essenciais, em embalagens tem como objetivo minimizar a contaminação microbiana em alimentos. No entanto, essa utilização é limitada por critérios sensoriais, sendo necessário determinar a concentração mínima necessária para inibir o desenvolvimento de micro-organismos sem afetar sensorialmente as características do alimento. Assim, os objetivos dessa pesquisa foram: determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de óleos essenciais (OE) para Listeria monocytogenes (LM); avaliar do efeito da combinação de óleos essenciais para a redução da população de LM; avaliar a combinação de compostos ativos presentes em óleos essenciais para a inibição de LM, Pseudomonas spp e Salmonella spp; avaliar in vitro e in situ a eficiência antimicrobiana do filme à base de alginato incorporado de compostos ativos presentes em óleos essenciais; determinar a disponibilidade dos compostos ativos incorporados ao filme pela determinação dos compostos fenólicos totais; caracterizar o filme frente às propriedades mecânicas e propriedades de barreira, e verificar a aceitação pelo consumidor, através da análise sensorial, de fatias de salame embaladas com o filme antimicrobiano. Constatou-se que a combinação de eugenol (0,01%) e limoneno (0,04%) apresentou um maior efeito para a redução da população de LM comparado ao uso individual desses compostos, confirmando, portanto, a existência de sinergismo entre esses dois compostos. Em relação à Pseudomonas spp, o sinergismo foi constatado quando as concentrações de eugenol (0,15%) e de limoneno (0,30%) foram utilizadas, no entanto, para Salmonella spp o mesmo efeito não foi observado. Em ensaios in vitro apesar do aumento na concentração de eugenol e limoneno incorporados à matriz do filme, não houve diferença significativa para os valores de zona de inibição antimicrobiana porém, em ensaios in situ, a utilização desse filme como embalagem primária promoveu a redução de 2 log UFC/g da população de LM até o 10º dia de análise permanecendo constante até o 30º dia o que não ocorreu com a combinação de eugenol (0,15%) e limoneno (0,3%). A quantificação dos compostos fenólicos totais nas amostras mostrou que há correlação entre o teor de compostos fenólicos extraídos da amostra do filme e o comportamento de LM. As propriedades mecânicas e de barreira do filme à base de alginato não foram significativamente afetadas pelas concentrações de eugenol e limoneno avaliadas neste estudo. O sabor, o aroma e a aparência das amostras de salame foram aceitos pelos provadores mostrando que o uso do filme à base de alginato incorporado com eugenol e limoneno é viável para a aplicação como embalagem antimicrobiana para o controle de L. monocytogenes em salame fatiado. Este resultado é considerado importante, pois em alimentos com atividade de água e valores de pH adequados à multiplicação desse patógeno e armazenados sob refrigeração, a temperatura é capaz de selecionar a microbiota presente no alimento, favorecendo a multiplicação de micro-organismos psicrotróficos, como L. monocytogenes

The incorporation of antimicrobial substances in packages aims at reducing food microbial contamination among which the phenolic compounds extract from plants have received special attention being natural and attending consumer demand. However, the use of these compounds is limited by sensory criteria and it is necessary to determine the minimum concentration required to inhibit the growth of microorganisms without affecting the sensory characteristics of the food. The aim of this research were: to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of essential oils (EO) for Listeria monocytogenes (LM); to evaluate effect of the combination of essential oils in order to reduce LM population; to evaluate the active compounds combination for the inhibition of LM, Pseudomonas spp, and Salmonella spp; to evaluate the antimicrobial efficiency in vitro and in situ of the alginate film incorporated with the active compounds; to determine the availability of the active compounds incorporated into the film for the determination of total phenolic compounds; to characterize the mechanical and barrier properties of the film, and to verify consumer acceptance of slices of salami packaged with the antimicrobial film. The combination of eugenol (0.01%) and limonene (0.04%) showed a greater effect for reducing LM population compared to the individual use of these compounds, confirming the existence of synergism between these two compounds. Regarding Pseudomonas spp, synergism was observed when the concentrations of eugenol (0.15%) and limonene (0.30%) were used, however, the same effect was not observed for Salmonella spp. In in vitro tests, despite of the increase in the concentration of limonene and eugenol incorporated in the film matrix, no significant difference for the antimicrobial inhibition zone values was observed. In in situ tests, the film containing eugenol (0.3%) and limonene (0.6%) promoted the reduction of 2 log CFU/g of LM population in sliced salami, while the combination of eugenol (0.15%) and limonene (0.3%) did not have the same effect. The quantification of the phenolic compounds in the film samples showed that there is correlation between the content of phenolic compounds extracted from the film sample and LM behavior. The mechanical properties of the barrier film and the alginate were not significantly affected by eugenol, and limonene concentrations evaluated in this study. The taste, flavor and appearance of the salami samples were accepted by the panel showing that the use of the alginate-based film incorporated with limonene and eugenol are feasible for use as antimicrobial packaging for the control of L. monocytogenes in sliced salami. This is an important result, because in food matrix with water activity and pH suitable for the pathogen growth, the storage under refrigerated condition is able to select the psycrothophic microorganisms, such as L. monocytogenes

Adaptação e adaptação cruzada de Listeria monocytogenes aos compostos eugenol e carvacrol / Adaptation and Cross adaptation of Listeria monocytogenes to eugenol and carvacrol compounds

RESUMOA evolução de certos microrganismos permite sua rápida adaptação aos ambientes em constante mudança, desenvolvendo assim, tolerância ou resistência ao aumento de determinados estresses. O uso de compostos bioativos provenientes da flora nativa tem sido apontado como uma possível solução para os problemas de controle da resistência e proliferação bacteriana. Este trabalho visou verificar a adaptação e adaptação cruzada de L. monocytogenes, frente aos compostos fenólicos eugenol e carvacrol. A concentração mínima inibitória (CMI) dos compostos fenólicos foi determinada pela técnica de microdiluição em placas de 96 cavidades, em caldo TSB + 0,5% de Tween 80. As concentrações finais (%) obtidas foram: 0,06; 0,12; 0,24; 0,49; 0,98; 1,95; 3,9; 6,25; 12,5; 25; 50. A suspensão bacteriana padronizada foi inoculada nas cavidades das placas, as quais foram incubadas a 37°C por 24 horas com posterior leitura da absorbância a 620 nm e determinação da CMI. A adaptação das células de L. monocytogenes ao eugenol e carvacrol foi realizada com o cultivo das células em TSB + 0,06% de eugenol ou carvacrol à 37°C por 2 horas. A cultura foi então centrifugada e as células ressuspendidas e padronizadas em TSB. A seguir, realizou-se novamente a técnica de microdiluição em caldo. Os resultados obtidos demonstraram que L. monocytogenes apresentou adaptação e adaptação cruzada frente ao carvacrol e eugenol. A CMI do eugenol e carvacrol foi de 24%. A pré-exposição de L. monocutogenes a concentração sub-letal de 0,06% de carvacrol ou de eugenol aumentou sua resistência. A pré-exposição ao carvacrol promoveu a adaptação de L.monocytogenes a ele aumentando a CMI para 12,5%. Já para o eugenol a CMI passou para 25%. Quando submetidas à concentração sub-letal de eugenol, este promoveu a adaptação das células tanto ao carvacrol quanto ao eugenol, sendo a CMI de 12,5%. Os resultados obtidos demonstraram que L. monocytogenes apresentou adaptação e adaptação cruzada ao carvacrol e eugenol. O presente trabalho sugere estudos futuros ainda mais abrangentes quanto à potencialidade antimicrobiana destes compostos.

ABSTRACTSome microorganisms have evolved and therefore are able to rapidly adapt themselves to a constantly changing environment, thus developing tolerance or resistance to the increase of some specific stresses. The use of bioactive compounds from the native vegetation has been pointed out as a possible solution to the problems of control of bacterial resistance and proliferation. This work aimed to check the adaptation and cross adaptation of L. monocytogenes, towards the phenolic compounds eugenol and carvacrol. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the phenolic compounds was determined by the microdilution technic in plates of 96 cavities, in CALDO TSB + 0,5% of Tween 80. The final concentrations (%) obtained were: 0,06; 0,12; 0,24; 0,49; 0,98; 1,95; 3,9; 6,25; 12,5; 25; 50.The patronized bacterial suspension was inoculated into the captivities of the plates, and incubated at 37°C for 24 hours with posterior reading of the absorbance at 620 nm and determination of the MIC. The adaptation of the cells of L. monocytogenes to the eugenol and carvacrol was made through the cultivation of the cells in TSB + 0,06% of eugenol or carvacrol at 37°C for 2 hours. The sample was then centrifuged and the cells were re-suspended and patronized in TSB. After that, the microdilution technic was performed one more time. The obtained results revealed that the L. monocytogenespresented adaptation and cross adaptation to the eugenol and carvacrol. The eugenol and carvacrol CMI was at 24%. The pre-exposition of L. monocytogenes to sub-lethal doses of 0,06% of eugenol or carvacrol enhanced its resistance. The pre-exposition to carvacrol promoted the adaptation of L. monocytogenes to it thus increasingthe MIC to 12,5%. To the eugenol the CMI got to 25%. When submitted to sub-lethal concentrations of eugenol, the latterpromoted the adaptation of the cells to carvacrol and eugenol, bringing the CMI to 12,5%. The obtained results showed that theL. monocytogenespresented adaptation and cross adaptation to the eugenol and carvacrol. The current work suggests future studies even broader regarding the antimicrobial potentialityof these compounds.

Structural features of the two-component systemLisR/LisK suggests multiple responses for the adaptation and survival of Listeria monocytogenes

Se caracterizó la estructura del sistema deregulación de dos componentes LisR/LisK de Listeriamonocytogenes. Se emplearon herramientas bioinformáticas ybases de datos para predecir la estructura e interacciones delas dos proteínas y se modelaron. Los resultados predicenque la proteína LisK está embebida en la membrana celulary su composición modular (dominios HAMP, histidinakinasa and ATPasa) está asociada a su autofosforilación(His-266). Un efecto estímulo respuesta determina lapropagación secuencial de la señal desde la membranacelular hacia componentes citoplasmáticos. A su vez, sepredice que LisR es una proteína citosólica con un dominiode receptor (homólogo a cheY) que incluye el residuofosfo-aceptor (Asp-52) y el dominio de unión a ADN,el cual puede permitir la transmisión de una respuestaespecífica a nivel transcripcional. Los componentes LisR/LisK han sido bioquímica y funcionalmente caracterizadosexperimentalmente en la patofisiología de otros bacilos. Espor ello, que la aproximación de los resultados basados enestructura-función podría facilitar el diseño de inhibidoresespecíficos...

Here, we characterized the structure of the two-component regulatory system, LisR/LisK, in Listeriamonocytogenes. To predict the structure of both proteins and the relationship between them, we employedseveral bioinformatic tools and databases. Based on our results, LisK protein is embedded in the cellmembrane and its modular composition (HAMP, histidine kinase and ATPase domains) is associatedwith its autophosphorylation (His-266). A stimulus-response likely determines the sequential signalpropagation from the bacterial cell surface to its cytoplasmic components. According to our results,LisR is a cytoplasmic protein with a receptor domain (homologous to CheY) that comprises a phosphoacceptorresidue (Asp-52) and a DNA-binding domain, which may allow the transmission of a specifictranscriptional response. LisR/LisK has been experimentally characterized both biochemically andfunctionally in other Bacilli pathophysiology; our structure-function approach may facilitate the design ofsuitable inhibitors...

O objetivo do estudo foi caracterizarestruturalmente o sistema de regulação de dois componentesLisR/LisK de Listeria monocytogenes. Foram utilizadasdiversas ferramentas de bioinformática e bancos de dadospara predizer a estrutura das duas proteínas, modelálase prever suas interações. Os resultados predizemque a proteína Lisk está incorporada na composição damembrana celular e sua composição modular (domíniosHAMP, histidina quinase e ATPase) está associada com asua autofosforilação (His-266). Um efeito de estímulo eresposta determina a propagação sequencial do sinal a partirda membrana celular em componentes citoplasmáticos. Osresultados predizem que LisR é uma proteína citosólicacom um domínio recetor (homólogo a CheY) que inclui oresíduo fosfo-aceitador (Asp-52) e o domínio de ligação aoADN, o que pode permitir a transmissão de uma respostaespecífica a nível transcricional. Como LisR/Lisk foi,química e funcionalmente, caracterizada experimentalmentena fisiopatologia de outros bacilos, esta abordagem baseadana estrutura-função pode facilitar a conceção de inibidoresespecíficos...

Distribución de serotipos de Listeria monocytogenes aislados de alimentos, Colombia, 2000-2009 / Distribution of Listeria monocytogenes serotypes isolated from foods, Colombia, 2000-2009

Introducción. Listeria monocytogenes es un patógeno facultativo intracelular, oportunista, causante de graves infecciones en humanos, como meningitis, encefalitis y bacteriemias; también, es causa de abortos. Los alimentos actúan como medio de transporte para infectar al huésped. La serotipificación ha discriminado trece serotipos: 1/2a,1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7. El 4b es causante de la mayoría de listeriosis en el mundo. Objetivo. Determinar la frecuencia en Colombia de los serotipos de L. monocytogenes aislados de alimentos, durante los años 2000-2009. Materiales y métodos. Se trata de un estudio descriptivo y retrospectivo. Se analizaron 1.599 aislamientos, los cuales fueron confirmados como L. monocytogenes y otras especies de Listeria, con pruebas bioquímicas recomendadas por la Food and Drug Administration (Estados unidos) y utilización del sistema bioquímico api Listeria Biomérieux,serotipificadas con la metodología de Seeliger y Höhne. Resultados. De los 1.599 aislamientos, 1.424 fueron confirmados como L. monocytogenes. Los serotipos encontrados fueron: 1/2a con 135 (9,5 %); 1/2b, 154 (10,8 %); 1/2c, 68 (4,8 %); 3a, 4 (0,3 %); 3b, 29 (2,0 %); 3c,2 (0,1 %); 4a, 44 (3,1 %); 4b, 820 (57,6 %); 4c, 6 (0,4 %); 4d- 4e, 140 (9,8 %); 4e, 17 (1,2 %); 7, 2 (0,1 %); y tres no serotipificables, (0,2 %). Los aislamientos procedían principalmente de Bogotá, 1.035 (73 %); de Antioquia, 199 (14 %); de Nariño, 109 (8 %); del Valle del Cauca, 50 (3,5 %), y de otros departamentos, 33 (2,3 %). Conclusión. En los aislamientos analizados, 1.424 (89 %) correspondieron a L. monocytogenes, presentando una buena calidad en el aislamiento e identificación; la mayoría de estos aislamientos pertenecían al serotipo 4b, 820 (57,6 %), serotipo muy virulento. Se recomienda la vigilancia obligatoria de este microorganismo.

Introduction. Listeria monocytogenes is an intracellular, opportunistic pathogen which can cause severe infections such as meningitis, encephalitis and bacteremia. It can also cause abortions in human beings. Foods are the vehicle for infection of the host. Serotypification has discriminated 13 serotypes: 1/2a,1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7. 4b is the cause of the majority of cases of listeriosis in the world. Objective. The frequency of serotypes of L. monocytogenes was determined in bacteria isolated from foods in Colombia. Materials and methods. The study is descriptive and retrospective. Over a 10-year period, 2000-2009, 1,599 isolates were examined. All were confirmed as Listeria monocytogenes and other strains of Listeria, using biochemical tests recommended by the Food and Drug Administration (USA) and API Listeria and serotyped using the Seeliger and Höhne method. Results. Of the 1,599 isolates, 1,424 were confirmed as L. monocytogenes. Serotypes identified were: 1/2a, 135 (9.5%); 1/2b, 154 (10.8%); 1/2c, 68 (4.8%); 3a, 4 (0.3%); 3b, 29 (2.0%); 3c, 2 (0.1%); 4a, 44 (3.1%); 4b, 820 (57.6%); 4c, 6 (0.4%); 4d- 4e, 140 (9.8%); 4e, 17 (1.2%); 7, 2 (0.1%); not susceptible of serotypification, three cases, (0.2%). Isolates came mainly from the Capital District of Bogotá, 1,035 (73%); from Antioquia 199 (14%), from Nariño, 109 (8%); from Valle del Cauca 50 (3,5%) and from other provinces 33 (2.3%). Conclusion. Of the analyzed isolates, 1,424 (89%) belonged to L. monocytogenes, showing a good quality in isolation and identification. Most of these isolates belonged to serotype 4b, 820 (57.6%), a highly virulent serotype. Obligatory surveillance of this microorganism is recommended.

Interações entre bactérias láticas produtoras de bacteriocinas e a microbiota autóctone de charque / Interactions between bacteriocin-producing lactic acid bacteria and the autochthonous microbiota from charqui

O charque é um produto cárneo tipicamente brasileiro, salgado e seco ao sol, ainda produzido de maneira artesanal. Durante sua produção há uma etapa de fermentação, realizada pela microbiota naturalmente presente na matéria-prima, o que dificulta a padronização do produto, e pode influenciar negativamente em suas características sensoriais e qualidade microbiológica. O controle da etapa de fermentação do charque seria uma alternativa para minimizar este problema e, neste contexto, as bactérias láticas produtoras de bacteriocinas se enquadram de forma interessante. A microbiota autóctone de charque inclui principalmente bactérias láticas e micro-organismos halofílicos e halotolerantes, sendo assim, este produto apresenta potencial como fonte para o isolamento de novas bactérias láticas produtoras de bacteriocinas. Assim, este trabalho teve por objetivo isolar e identificar culturas de bactérias láticas produtoras de bacteriocinas naturalmente presentes no charque, caracterizar parcialmente as bacteriocinas produzidas por essas culturas, avaliar seu potencial de aplicação neste produto para a melhoria de sua qualidade microbiológica e avaliar seu efeito na ecologia microbiana do charque, nas diferentes etapas de sua fabricação. Através da técnica de tripla camada em ágar foi isolada uma cepa de Lactococcus lactis subsp. lactis apresentando o gene codificador para nisina Z e com capacidade de inibir, in vitro, micro-organismos medianamente e altamente halotolerantes isolados de charque, além de outros micro-organismos deteriorantes e patogênicos importantes em alimentos, como Lactobacillus spp., Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. A bacteriocina produzida pela cepa isolada neste estudo também possui características interessantes para sua aplicação na bioconservação de alimentos, como resistencia ao calor, presença de agente químicos e altos teores de NaCl, além de não ser afetada pelo pH. A aplicação dessa cepa em charque modelo resultou na redução de até 2 ciclos log na população de micro-organismos halotolerantes, indicando apresentar um potencial de aplicação como agente de bioconservação do produto. Os ensaios de avaliação da ecologia microbiana, empregando DGGE, indicaram que a fermentação natural do charque ocorreu com a participação de bactérias láticas dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus e de micro-organismos halotolerantes do gênero Staphylococcus. Além disso, os estudos referentes à dinâmica populacional demonstraram que a adição da cepa bacteriocinogênica ao charque não influenciou, de forma qualitativa, as populações presentes no produto

Charqui is a Brazilian traditional meat product, salted and sun-dried, still manufactured without control of the fermentation step, which is performed by the indigenous microbiota. This fact interferes on the standardization of the product and can negatively affect the sensorial properties and microbiological quality. The application of a known microbiota would be an alternative to minimize this problem and the bacteriocin-producing lactic acid bacteria can can fit in this purpose. The charqui indigenous microbiota mainly includes lactic acid bactéria and halophilic and halotolerant microorganisms, therefore, this product presents a potencial as a source for the isolation of new bacteriocin-producing lactic acid bacteria. The aim of the present work was to isolate and identify bacteriocin-producing lactic acid bacteria from charqui, characterize the bacteriocins produced by the isolated culture, evaluate its potential as biopreservative in charqui and its influence on the microbial populations during the manufacture of the product. A bacteriocinogenic Lactococcus lactis subsp. lactis strain was isolated from charqui through the triple-layer agar technique. This strain produces a nisin-like bacteriocin capable to inhibit in vitro medium and highly halotolerant bacteria isolated from charqui and other food-borne pathogenic and spoilage microorganisms. The application of this strain for charqui manufacturing caused a reduction of up to 2 log in the halotolerant bacteria population, evidencing its potential application for charqui biopreservation. Studies in the populational dynamics using DGGE indicated that the presence of the bacteriocinogenic strain did not affect the microbial populations in the product

Evaluación de la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la detección e identificación de Listeria monocytogenes en queso fresco proveniente del Área Metropolitana de San José, Costa Rica / Evaluation of the polymerase chain reaction (PCR) for the detection and identification of Listeria monocytogens in fresh cheese coming from the Metropolitan Area of San José, Costa Rica

Las enfermedades de origen alimentario son muy importantes a nivel mundial y su frecuencia es persistentemente alta a pesar de diversos esfuerzos enfocados en disminuir su morbilidad y mortalidad. Listeria monocytogenes es uno de los agentes causantes de este tipo de enfermedad. Dentro de la industria láctea, esta bacteria es de especial importancia, ya que, tanto la leche cruda como derivados han sido involucrados en brotes, siendo el queso fresco un alimento especialmente vulnerable a la contaminación con esta bacteria. La identificación tradicional de este género es lenta, laboriosa y poco sensible. El método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) podría permitir el obtener resultados precisos y exactos en menor tiempo, razón por la que el objetivo de este estudio fue el optimizar un procedimiento para la detección de L. monocytogens en queso fresco, así como determinar los límites de sensibilidad, especificidad y valor predictivo de la prueba. Para lograr este objetivo, se evaluaron 76 muestras de queso blanco procesado (45 muestras inoculadas, 31 sin inocular como control negativo). La validación de la técnica fue realizada en 50 muestras de queso fresco no pasteurizado. El aislamiento tradicional de esta bacteria se siguió según la metodología descrita en el Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. La reacción de PCR para la detección de Listeria monocytogenes se basó en la metodología descrita por Poutou usando los iniciadores característicos del género y del gen de la listeriolisina O, específico de especie. Se determinó que el periodo óptimo de incubación para el caldo de enriquecimiento selectivo fue de 48 horas, y se obtuvo un 100% de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. La validación de la técnica demostró la especificidad de ésta en cuanto a detectar únicamente la especie L. monocytogenes, no así otras especies que aparecen con relativa frecuencia en matrices y ambientes alimentarios.

Food borne diseases are very important worldwide and their frequency is still high despite the different efforts focused in diminishing their morbidity and mortality. Listeria monocytogenes is one of the agents associated in this kind of diseases. In the lactic industry, this bacteria is important since raw milks as well as dairy products have been associated in outbreaks, being fresh cheese one of the most vulnerable products to the contamination with this bacteria. The traditional identification of the bacteria is done by a laborious, time consuming and low sensitive technique and the polymerase chain reaction may allow more precise and exact results in shorter time. For this reason the objective of the present study was to optimize the procedure to determine the sensitivity and specificity limits for the detection of L. monocytogenes from fresh cheese and the predictive value of the test. In order to achieve this objective, 76 pasteurized cheese samples were evaluated (45 samples were artificially inoculated at the lab and 31 were used as negative controls). The validation of the technique was done in 50 samples of non pasteurized fresh cheese. Traditional culture isolation was performed according to the methodology described in Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. PCR reaction for the detection of L. monocytogenes was based on the methodology described by Poutou,using primers characteristic of the genus and the listeriolisine O gene that is specie’s specific. The optimal incubation period determined for the selective enrichment broth was of 48h, and a 100% sensitivity, specificity, predictive value (positive and negative ) were obtained by PCR. The technique validation showed the specificity of the test in the detection of only the L. monocytogenes species, and not other genus or species that may appear in food matrixes or in food environments.

Multiplex-PCR serotyping of Listeria monocytogenes isolated from human clinical specimens

The genus Listeria is composed of six species of which Listeria monocytogenes is considered the single pathogenic species that causes listeriosis in humans. Of the 13 serovars of L. monocytogenes, 1/2a, 1/2b and 4b are responsible for the majority of clinical cases. The aim of this work was to detect L. monocytogenes in the cerebrospinal fluid sample of premature newborns and to characterize this sample using biotyping, serotyping and molecular typing. The results indicated the presence of L. monocytogenesin the clinical sample studied. Moreover, the isolate was identified as the 4b serovar that was characterized by the presence of a unique 691 bp band after analysis using the Multiplex-PCR technique. The results of repeated Multiplex-PCR and sequencing have indicated that the L. monocytogenes isolate was an atypical 4b serovar, which is the first time this finding has been reported.

En memoria de Lister / In homage to Lister

Joseph Lister, who disputes with Klebs the third place as the Father of Microbiology, was just about to remain without a bacteria immortalizing his ñame. Thanks to Seeliger, now Listeria is used for identifying the genus that Pirie had already named Listerella in 1927. Through a quick review of the history of Listeria monocytogenes, we get to know the principal facts in the lives of Pirie and Seeliger, investigators with absolutely different characters. We also review a brief history of the life of the great researcher Lister, whose profound human qualities are described.

Joseph Lister, quien disputa con Klebs el tercer lugar como Padre de la Microbiología, estuvo a punto de quedarse sin una bacteria que inmortalizara su nombre. Gracias a Seeliger hoy se denomina histeria al género que ya Pirie había propuesto como histerella en 1927. En una rápida revisión de la historia de histeria monocytogenes conocemos los hechos fundamentales en las vidas de Pirie y Seeliger, investigadores de caracteres encontrados, teniendo como fondo la inmensa figura de Lister, del cual se presentan, más que sus hallazgos y realizaciones científicas, sus condiciones humanas: su ética inquebrantable, su desinterés por los honores, su profunda religiosidad, su amor por su esposa Agnes y sus dificultades para exponer sus ideas con fluidez.

Estudio mediante PCR múltiple de serotipos de Listeria monocytogenes aislados en Argentina / Study by multiplex PCR of Listeria monocytogenes serotypes isolated in Argentine

Se comparó una PCR múltiple recientemente validada para la caracterización de serotipos de Listeria monocytogenes con el método tradicional de serotipificación. Se estudiaron 342 aislamientos de origen humano, alimentario, veterinario y ambiental obtenidos durante el período 1992-2005. La concordancia entre ambos métodos para los serotipos 1/2a, 1/2b y 1/2c fue del 100%, y para el serotipo 4b fue del 98%. La serotipificación constituye una herramienta importante como primer nivel de diferenciación de cepas de L. monocytogenes para llevar a cabo la vigilancia epidemiológica y, sobre todo, el estudio de brotes. La PCR múltiple es una técnica alternativa rápida, de bajo costo y fácilmente adaptable en laboratorios de bacteriología clínica y bromatología.

A multiplex PCR assay, recently validated to characterize the serotypes of Listeria monocytogenes was evaluated in comparison to conventional serotyping. Three hundred forty two L. monocytogenes strains isolated from human, food, animal and environmental sources during the 1992-2005 period were assayed. The concordance between the two methods for serotypes 1/2a, 1/2b and 1/2c was 100%, whereas for serotype 4b it was 98%. Serotyping is a useful tool for first line strain differentiation during epidemiological surveillance and outbreaks. The multiplex PCR assay offers a fast and low-cost alternative, which is easily adaptable to clinical bacteriology and bromatology laboratories.

Sorovares de Listeria monocytogenes e espécies relacionadas, isoladas de material clínico humano / Serovars of Listeria monocytogenes and related species isolated from human clinical specimens

A análise fenotípica de 255 amostras do gênero Listeria isoladas de material clínico humano, tanto de indivíduos doentes (220-86,3 por cento), como de aparentemente normais (35-13,7 por cento) de várias regiões do país e colecionadas no período de 1969 a 2000, permitiu caracterizar a distribuicão de sorovares de Listeria monocytogenes. Nas faixas etárias de 0 a 10 e de 41 a 60 anos, predominaram os isolamentos de líquido cefalorraquidiano sobre os de sangue, incluindo dos transplantados renais. Somente dos hemocultivos foi possível detectar os sete sorovares de Listeria monocytogenes. No cômputo geral, o sorovar 4b foi o mais incidente (154-60,3 por cento) secundado por /2 a (74-29 por cento) nos três decênios considerados, além de ocorrerem em quase todas as regiões do país. Os dados deste estudo evidenciaram a circulacão de L. monocytogenes na espécie humana, provocando quadros graves de meningite e septicemia, bem como, revelando a figura do portador assintomático, razão pela qual são recomendadas novas investigacões bacteriológicas, subsidiadas por análises clínico-patológicas e epidemiológicas.

Typing of Listeria monocytogenes isolates by random amplification of polymorphic DNA.

BACKGROUND & OBJECTIVES: Listeria monocytogenes is an important food-borne pathogen causing meningitis and septicaemia in newborns and immunocompromised persons, abortion and preterm labour in pregnant women. Though various methods are available for typing L. monocytogenes, RAPD analysis has been used for epidemiological purposes in developed countries due to its greater discriminating ability. However, as there are no published reports from India on the typing of L. monocytogenes by RAPD technique the present study was undertaken to type isolates of L. monocytogenes from clinical, food and veterinary samples. METHODS: Isolates of L. monocytogenes were subjected to RAPD using four decamer random primers R1, R2, R3 and R4. Amplified products were analysed by agarose gel electrophoresis. RESULTS: Eight strains of L. monocytogenes on RAPD analysis generated 4 distinct profiles each with R1 and R4 primers and 3 different profiles with R2 and R3 primers. The isolates from fish, clinical and veterinary samples showed different profiles with respect to each other. Isolate from flat fish (serovar 4) showed a different profile from that of clams (serovar 1). Two isolates from placenta (serovar 1) showed similar profiles and all the isolates from veterinary samples generated similar profiles. INTERPRETATION & CONCLUSION: RAPD analysis in the present study allowed discrimination of isolates among the same serotype but from different sources. Since RAPD is a rapid technique and offers greater discrimination of strains, this method may be used for typing L. monocytogenes in India.

Characterization of brazilian Listeria monocytogenes strains using DNA macrorestriction patterns

Vinte e uma linhagens de Listeria monocytogenes amostradas no Brasil, no período de 1989-90, procedentes de material clínico e alimentos foram identificadas, sorotipadas e fagotipadas de acordo com métodos tradicionais. Estas linhagens foram, também, tipadas quanto ao perfil de macrorestriçäo de DNA, após clivagem com ApaI, SmaI e NotI e separadas por eletroforese em campo pulsado. Os resultados obtidos evidenciaram uma grande heterogeneidade entre as linhagens: enquanto a sorotipagem dividiu dois sorogrupos (1/2 e 4), fagotipagem definiu oito fagovares e, finalmente, perfil de macrorestriçäo de DNA permitiu distinguir doze diferentes grupos. Estes resultados enfatizam a necessidade de caracterizaçäo de L. monocytogenes com, pelo menos, três diferentes métodos para definir se isolados säo similares ou näo, especialmente por ocasiäo de investigaçöes epidemiológicas da transmissäo alimentar da listeriose humana

Efecto de agregado de ácidos y temperatura sobre el desarrollo de listeria monocytogenes / Acids aggregated effect and temperature over listeria monocytogenes development

Listeria monocytogenes es un microorganismos patógeno asociado a enfermedades de origen alimentario que puede crecer y sobrevivir a temperaturas de refrigeración y a pH bajos. Se analiza el efecto de pH 3.0-6.5 dado por diferentes concentraciones de acidulantes (ac. cítrico, ac. láctico, y ac ascórbico) y de la temperatura de refrigeración (4 y 10ºC sobre el desarrollo y supervivencia de listeria monocytogenes en caldo de cultivo triptona soya y extracto de levadura. Se observó disminución de velocidad de desarrollo de l. monocytogenes al disminución la temperatura. El ácido cítrico resultó tener acción antimicrobiana más efectiva manteniendo los recuentos en fase de latencia a baja concentración. El ácido ascórbico fue el menos efectivo ya que la acción bactericida. Se observó a concentraciones muy altas, este junto con el ac. láctico presentaron un efecto inicial en el recuento de microorganismos. La información obtenida fue sintetizada mediante el índice de inhibición (II) y el efecto inhibitiorio (EI).

Infecciones perinatales: Listeria monocytogenes / Perinatal infections: Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes es un cocobacilo grampositivo, anaerobio facultativo, que ha sido relacionado con diversas infecciones humanas entre las que se incluye la perinatal. En México se desconoce la frecuencia de listeriosis; en una encuesta serológica por aglutinación usando antígeno somático y flagelar tipo 1 y 4b, se encontraron anticuerpos en 16.6% de embarazadas y en 7.9% de no embarazadas. Las infecciones en el recién nacido pueden ser tempranas o tardías, en el primer caso cursando con la forma septicémica y en el segundo principalmente como meningoencefalitis. El frotis directo de productos habitualmente estériles puede ayudar a establecer un diagnóstico presuntivo. L. monocytogenes crece bien en sangre de carnero; el medio CNA puede emplearse como selectivo para muestras polimicrobianas. Penicilina o ampicilina es el tratamiento de elección en infecciones por Listeria; la rifampicina puede ser una buena alternativa